PNAS︱张春立课题组揭示星形胶质细胞再生成为多谱系神经细胞
撰文︱张韵佳
责编︱王思珍
在胚胎发育过程中，神经干细胞产生神经元（neuron）和胶质细胞（glia），构成中枢神经系统[1]。在成年哺乳动物脑内，只有侧脑室的脑室下区（SVZ）和海马的颗粒下区（SGZ），存在少量神经干细胞（NSCs）能生成神经元，这一过程称为成体神经发生（adult neurogenesis）[2-3]。与有限的NSCs相比，大量存在的胶质细胞可通过命运重编程（fate reprogramming）而成为新生的神经元[4-7]。在脑损伤或者过表达单个或多个转录因子组合的情况下，研究者们已在多个非神经发生的区域（例如 纹状体、皮层、脊髓和视网膜）诱导原位的胶质细胞重编程成为神经元[8-17]。然而，神经网络的建立，不仅需要神经元，还需要胶质细胞。多谱系分化将为神经再生（regeneration）提供全部三种神经细胞（即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞）。然而，胶质细胞的多谱系命运重编程尚未有报道。
2022年3月7日，美国德克萨斯州大学西南医学中心的张春立课题组和Gary Hon课题组合作在PNAS上发表了题为“A single factor elicits multilineage reprogramming of astrocytes in the adult mouse striatum”的文章，揭示了在成年小鼠纹状体中的星形胶质细胞，可被单个转录因子DLX2重编程产生多谱系神经细胞，即神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。并且其重编程过程与内源性神经发生具有高度相似性，需要通过激活DLX家族和抑制Notch信号通路来实现。星形胶质细胞具备神经干细胞特性。张韵佳和李伯勋为论文共同第一作者，张春立教授和Gary Hon教授为论文通讯作者。
在小鼠纹状体中大多数神经元是GABA神经元。通过在纹状体注射慢病毒表达促进GABA神经元分化的转录因子（例如LV-GFAP-DLX2），筛选能够促使星形胶质细胞重编程的转录因子。作者对新生神经元进行DCX染色，发现DLX2单独表达可以诱导成年小鼠纹状体产生大量的DCX细胞，即新生神经元，并且DCX细胞的大量产生发生在DLX2表达第三周后，并在第四周达到高峰。用携带GFP标签的载体DLX2-IRES-GFP检测重编程效率约为55%。BrdU参入实验显示，90%以上的DCX细胞与BrdU共定位，表明DLX2诱导的重编程产生的DCX细胞，经过了增殖过程。作者进一步利用谱系追踪实验研究新生神经元的来源，结果显示，DCX细胞不是从内源SVZ迁移过来的，而是在纹状体部位产生的，并且DCX细胞来自于星形胶质细胞的重编程，而非NG2胶质细胞（图1）。
图1 DLX2诱导成年小鼠星形胶质细胞重编程。
（图源：Yunjia Zhang, et al., PNAS, 2022）
在内源性神经生成过程中，DCX细胞是由ASCL1 NPC分化来的。利用ASCL1染色、谱系追踪实验，作者发现，DLX2能够诱导星形胶质细胞重编程为ASCL1 NPC，进而分化成DCX细胞。并且，星形胶质细胞的命运改变发生迅速，在DLX2诱导的2周内，90%以上胶质细胞均发生了命运转变。作者进而对NPCs分化成为成熟神经元进行了检测。利用ASCL1谱系追踪小鼠，发现DLX2诱导产生的NPCs能够分化成为GABA神经元，其中51%是CTIP2+神经元，CTIP2是纹状体发育和medium spiny neuron分化的关键转录因子，而作者检测到的DARPP32（成熟medium spiny neuron的marker）细胞数量很少，说明在此时诱导产生的CTIP神经元尚未分化成为成熟的medium spiny neuron（图2）。除medium spiny neuron之外，作者还检测到了Calretinin神经元，但是并未观察到PVALB、 SST或者Calbindin神经元。以上结果表明，DLX2将星形胶质细胞重编程为ASCL1 NPC细胞，ASCL1 NPC细胞分化为DCX细胞，DCX细胞进而分化成为纹状体GABA神经元。
图2 重编程的星形胶质细胞成为ASCL1 NPC，最终分化成为GABA神经元。
（图源：Yunjia Zhang, et al., PNAS, 2022）
在用ASCL1谱系追踪小鼠研究DLX2诱导的成熟神经元过程中，作者发现除了DCX和成熟神经元之外，还产生了一些胶质细胞形态的细胞。作者在不同时间点对DLX2 诱导的所有细胞类型进行分析，发现DLX2诱导的ASCL1 NPC 具有多能干细胞特性，能够分化成为神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞。有趣的是，在前8周，ASCL1 NPC分化的神经元和与胶质细胞的比例为4﹕1，而在第12周，神经元与胶质细胞比例为1﹕1，大量的胶质细胞分化，并且少突胶质细胞逐渐分化成熟，表达MBP。这与体内神经发生相似，神经元的产生早于胶质细胞的生成，而最终神经元与胶质细胞的比例相当（图3）。
图3 NPC具有多能干细胞特性。
（图源：Yunjia Zhang, et al., PNAS, 2022）
为了研究DLX2诱导的重编程过程的分子机制，作者对脑内重编程环境进行了单细胞测序分析。伪时序分析结果重现了星形胶质细胞命运转变的过程，星形胶质细胞重编程为NPCs，经过分化依次形成早、中、后期神经元。这一结果也与谱系追踪实验结果一致。通过对关键通路（GO）和转录因子调节子（regulons）分析，作者发现，静息状态的星形胶质细胞在感染慢病毒表达的DLX2后，依次经过线粒体代谢方式转变、免疫应答、DNA修复、细胞周期改变、转录和翻译、神经系统发育、轴突导向等一系列过程，实现神经生成（图4）。在鉴定的转录因子调节子中，DLX家族DLX1、DLX2、DLX5均被激活。作者进一步对DLX家族的重编程能力进行体内实验验证，结果显示DLX1、DLX2、DLX5均能诱导星形胶质细胞再生，但DLX2诱导的重编程不依赖于DLX1和DLX5的表达，提示DLX2、DLX1、DLX5在重编程过程中发挥冗余作用。有文献表明，Notch信号通路在星形胶质细胞中高度激活，而其下调可促进神经生成。作者进一步检测了Notch通路在DLX2诱导重编程中的作用。同时过表达DLX2和NICD（cleaved Notch1 intracellular domain）致使DCX细胞的数量显著下降，表明DLX2诱导的重编程依赖于Notch信号通路的抑制。接着作者研究了重编程过程是否为细胞自主性改变，在诱导重编程2周时，80%的ASCL1细胞中都能检测到DLX2的表达，表明星形胶质细胞在感染DLX2后发生了自主性命运变化，转变为ASCL1NPC。
图4 sc-seq显示星形胶质细胞命运转变机制。
（图源：Yunjia Zhang, et al., PNAS, 2022）
与内源性神经生成相似的是，DLX2诱导的细胞命运转变也经历了ASCL1 NPC阶段。因此，作者分析了重编程过程是否与内源性神经生成在转录水平是否具有相似性。通过与E18.5小鼠脑单细胞数据进行对比，发现DLX2表达的星形胶质细胞与内源性神经干细胞相似，从静息状态，经过Rpf32和Egfr等基因的上调进入活化状态，通过Cdk1、Ccna2、MKi67等基因的上调进入细胞周期，最后激活DLX1/2、DCX等基因实现神经生成。这一结果提示激活的星形胶质细胞具有内源性神经干细胞特性。作者接着分析了重编程与内源神经生成的不同点，通过对DEG的分析，发现主要的DEG差异是由细胞周期改变和对病毒感染的免疫应答引起的（图5）。作者进而对比了成年小鼠海马区神经生成的单细胞数据，结果显示重编程过程与成体神经生成在转录水平也高度相似。综上结果表明，DLX2诱导的重编程在转录水平上，与成体神经生成和胚胎期神经发育都十分相似，激活的星形胶质细胞具有内源神经干细胞特性。
图5 sc-seq显示重编程的星形胶质细胞具有神经干细胞特性
（图源：Yunjia Zhang, et al., PNAS, 2022）
该研究筛选了诱导神经再生的转录因子组合，发现DLX2单独表达能够诱导成年小鼠纹状体星形胶质细胞再生为神经元。应用谱系追踪技术，发现DLX2在两周内迅速诱导成年小鼠纹状体星形胶质细胞再生成为ASCL1 NPC，进而分化成为多谱系神经细胞，即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结合单细胞测序等技术，研究者揭示了星形胶质细胞重编程的转录水平的调控机制及关键调控通路和调节子，例如激活DLX家族和抑制Notch信号通路。重编程过程与胚胎期侧脑室区的神经干细胞分化过程极为相似，并且也与成体海马区神经生成在转录水平上高度吻合，均由静息态，经过活化态，细胞周期改变，实现神经生成。该研究中DLX2诱导的ASCL1 NPC，产生的多谱系神经细胞，是否具有同样的ASCL1 NPC来源尚有待于进一步验证。除此之外，实验中使用的慢病毒载体表达的DLX2蛋白，促使分化成熟的星形胶质细胞产生多能干细胞特性，然而在AAV介导的重编程体系中，并未观察到神经再生。因此对重编程分子机制的详细解析是十分必要的。综上，该研究发现星形胶质细胞可再生为多谱系神经细胞，为神经损伤修复提供了理论基础，因为神经损伤会导致三种谱系细胞的丢失，多谱系神经细胞的再生将弥补全部神经细胞类型的缺失。此外，该研究也为成年哺乳动物脑的可塑性提供了新的视角和依据。
原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2107339119
第一作者张韵佳（左1）、李伯勋（左2）； 通讯作者张春立（右2）、Gary Hon（右1）
（照片提供自：张春立实验室和Gary Hon实验室）
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制版︱王思珍
本文完